富硒酵母提取物对小鼠乳腺肿瘤细胞生长抑制作用及肿瘤细胞硒蛋白mR NA表达调控的探讨

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论文字数:55858 论文编号:sb2022022510192844210 日期:2022-02-26 来源:硕博论文网
本文是一篇医学论文,笔者通过动物实验发现,不同硒源化合物在超剂量(80 倍日常需求量)使用时均可抑制小鼠乳腺肿瘤(4T1 模型)生长的作用。对比结果显示,SEYE-5668 的抑制肿瘤生长、转移的作用最明显,且对肝脏和肺脏组织产生的副作用最小。

第一章 硒及富硒酵母功能的研究

1 硒的生物学功能概述
1818 年,瑞士化学家 Berzelius 在研究生命体与无机元素的关系中发现了一种新无机元素,成功提取并以月亮女神 Selene 的名字命名为硒(Selenium,Se )(Albertoet al., 2011)。经过数十年的不断探索,硒元素逐渐被认为是生命不可或缺的微量元素之一(Navarro et al., 2008),被称之为“抗癌之王”(Thirunavukkarasu et al., 2003)。
随着对硒元素的研究,揭示和验证了硒的多种生理功能,主要包括:抗氧化、促发育(Weeks et al., 2012)、抗肿瘤(赵洪进 等,2007)、抗病毒,增强免疫作用与抗病作用(王明洋 等,2016),提高巨噬细胞的杀菌能力和延长巨噬细胞的寿命(Vuntaet al., 2008),调节机体代谢、清除自由基(刘海 等,2007)、保护生物膜完整性(Jianget al., 2000)、能量代谢(Köhrle et al., 2005)和防止胞内核酸、蛋白质等生物大分子损坏(Kieliszek et al., 2015)、有毒元素的拮抗(Mehdi et al., 2013)等。
另外,硒还能增强人和动物的生殖机能(Fortier et al., 2012),具有抗延缓衰老(Sujuan et al., 2008),和 V E 能协同保护机体免受自由基的侵害(陈敏 等,2005)。其中抗氧化性是硒的生化作用基础(Glorieux et al., 2017),可将氢过氧化物或 H2O2还原成醇类或水(秦粉菊 等,2007)。
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2 硒蛋白的生物学作用概述
一般将动物组织的硒分为非蛋白结合硒和蛋白结合硒。非蛋白结合硒主要为硒的中间代谢产物,占血液总硒的 2~4%(Davis et al., 2012)。蛋白结合硒主要为含有硒代半胱氨酸( SeC )和硒代蛋氨酸( SeM )的蛋白质以及硒结合蛋白,占血液总硒的 96~98%(Jr et al., 2001)。当硒被摄入体内,90%以上通过各种形式转换成 SeC和 SeM 掺入硒蛋白,仅 5%存在于小分子代谢产物中(Rodrigo et al., 1998),从广义上讲,凡是具有硒原子参与的蛋白质都可以指为硒蛋白(Mcginnis et al., 1980)。
迄今为止,现约有一百种硒蛋白已被发现,但其中至少有一半的功能仍不为人所知(Tastet et al., 2008)。主要包括谷胱甘肽过氧化物酶族(glutathione peroxidases,GPX S,人类有 5 种、啮齿类有 4 种)、硫氧还蛋白还原酶族(thioredoxin Reductases,Txnrd S,有 3 种)(Dikiy,2007)、脱碘酶族(deiodinases,DIO S,有 3 种)、硒代磷酸合成酶 2(SPS 2)、硒蛋白 15(Sep 15)(Kumaraswamy et al., 2002)、硒蛋白 H、硒蛋白 I、硒蛋白 K、硒蛋白 M、硒蛋白 N(Petit et al., 2003)等。
硒蛋白的主要生物功能为调控机体的氧化还原平衡(Zoltán et al., 1998)、甲状腺激素代谢以及免疫反应(Mallonee et al., 2011)和酶调节作用(Plano et al., 2011)。目前根据文献证实(Mueller et al., 2009),在体内硒能够作为抗氧化活性中心的酶主要有硫氧还蛋白还原酶(Txrnd S)、硒蛋白 R 和谷胱甘肽过氧化物酶(GPX S)等。抗氧化酶通过催化氧化还原反应来减轻活性氧自由基给生物体造成的损伤(Avelliniet al., 1999)。其中 GPX S 是最早发现的硒蛋白,它和 Txrnd S 在调节细胞氧化还原状态、清除体内产生的过量活性氧等方面发挥重要作用(Reeves et al., 2009)。
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第二章 酿酒酵母的富硒培养和破碎方法的建立

1 材料
1.1 菌种
酿酒酵母( Saccharomyces cerevisiae ) SWUN5668 株 从牦牛酸奶中分离得到,由西南民族大学畜牧兽医学院动物医学实验室保存。
1.2 主要试剂
酵母粉(1401907-02),胰蛋白胨(1745198)购自 OXOID 公司;无水葡萄糖购自福晨化学试剂厂;亚硒酸钠购自 Sigma 公司;硫代乙醇酸钠(R014833)购自美伦宝公司;蜗牛酶(S8283)购自北京索莱宝科技有限公司。
1.3 主要试验
仪器ICP-MS(NexION 2000),Perkin Elmer(PE);冷冻干燥机(LyoQuest-85),Telstar;超声细胞破碎仪(JY88-ⅡN),宁波新芝生物科技有限公司;超微量核酸蛋白测定仪(5225 Verona Rd),Thermo Fisher;细菌浊度仪(WGZ-2XJ),上海欣瑞仪器仪表有限公司;振荡仪(ORAGONLAB MX-S),鸿运科技发展有限公司。
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2 方法
2.1 酿酒酵母不同生长时间培养液 OD 的值测定
按照吴梅(2016)在文献里的操作步骤,先将冻存的菌种接种于 YEPD 固体培养基平板,置于恒温培养箱培养 48h,挑选单菌落复苏成种子液(1×108CFU/mL),然后接种到 YEPD 液体培养基中,之后每隔一段时间无菌取样 10mL,用细菌浊度计测定菌悬液 MCF 值。为保证获得更精确的生长曲线图,根据参考文献,在保证原有采样时间的前提下,对生长曲线各折点前后采样间隔均为 1h。(1MCF=3×108 CFU/mL)。
2.2 酿酒酵母的富硒培养与生物量的测定
在前人试验结果的基础上,将种子液(1×108CFU/mL)按照 10%(V/V)接种YEPD 液体培养基中进行发酵培养,在 28℃条件下以 200 r/min 转速于恒温摇床上连续培养至生长曲线平台期,添加亚硒酸钠贮备液至 YEPD 液体培养基硒浓度为 11、12、13、14、15、16、17、18、19μg/m L。继续培养 36h 后测定酵母菌的生物量。
生物量的测定:参照印宏绯等(2008)所述方法,取 40m L 液体培养基用离心机于 4000 r/min 离心 15min 后,取沉淀用 ddH2O 洗涤 3 次,置于-80℃冷冻过夜,0.3MBar,-80℃冻干 24h,所得的干重与发酵液体积的比值即为菌体生物量,结果用g/L 表示。
2.3 富硒酵母的破碎和破碎物硒含量的测定
按照前述试验优化培养条件和最优加硒浓度培养酿酒酵母 SWUN5668 株,离心洗涤沉淀,冷冻干燥 24h,经研磨后过 200 目筛,保存于-80℃保存备用。
取 1.0g 干酵母置于 15mL 离心管,加入 2.00mL 0.4 μmol/L 硫代乙醇酸钠溶液,于 37℃震荡水浴锅作用 0.5h,然后用离心机,5000r/min,4℃离心 5min,收集沉淀按1:10(W/V)用ddH2O洗涤沉淀2次,重新悬浮于1mL含50mg蜗牛酶的 HBSS basic,在 37℃震荡水浴锅作用 2h。
医学论文参考
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第三章 不同含硒物对小鼠乳腺肿瘤细胞的影响...........................20
1 材料...........................................20
1.1 乳腺肿瘤细胞系...................................20
1.2 主要试剂........................................20
1.3 主要试验仪器...........................20
第四章 不同含硒物对小鼠乳腺肿瘤细胞硒蛋白 mRNA 调控的影响........................ 43
1 材料........................................43
1.1 乳腺肿瘤细胞系.......................................43
1.2 主要试剂..................................................43
1.3 主要试验仪器.........................................43
第五章 不同含硒物对小鼠乳腺肿瘤的抑制和对肝、肺、脾的影响............................59
1 材料............................59
1.1 试验细胞..............................59
1.2 试验小鼠.......................................59
1.3 主要试验试剂............................................59

第五章 不同含硒物对小鼠乳腺肿瘤的抑制和对肝、肺、脾的影响

1 材料
1.1 试验细胞
小鼠乳腺肿瘤细胞(4T1 细胞系)由西南民族大学畜牧兽医学院动物医学实验室保种,冻存于液态氮中。
1.2 试验小鼠
Balb/c 雌性小鼠,SPF 级,鼠龄 4~5 周龄,体重 15-16g,购自成都达硕实验动物公司,购入后先在西南民族大学畜牧兽医学院动物房适应饲养一周。
1.3 主要试验试剂
4%多聚甲醛溶液(AR106)购自 BOSTER 公司;无水乙醇(GB678-90)购自成都海兴化工试剂厂;二甲苯(AR 级)(20200601)购自天津市致远化学试剂有限公司;苏木素染液(ZH193907)购自武汉塞维尔生物科技有限公司;伊红染液(C200403)购自珠海贝索生物技术有限公司;细胞培养药品参考第三章。
1.4 主要试验仪器
转轮式切片机购自徕卡-德国公司;自动组织脱水机(JT-12S)购自武汉俊杰电子有限公司;包埋机(MJ-A)购自中威电子仪器厂;全自动染色机(RS36)购自常州派斯杰医疗设备有限公司;病理组织漂烘仪(PHY-Ⅲ)购自常州市中威电子仪器有限公司;数字切片扫描仪(Pannoramic 250)购自济南丹吉尔电子有限公司。
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结论与创新点

结论
1. 对 SWUN5668 株酿酒酵母,通过提高培养基中亚硒酸钠的含量,可以将培养产物硒含量提升至 2781μg/g。运用蜗牛酶酶解联合超声破碎,可以提升酵母细胞的破碎率至 97.62 ± 2.33%。经过测量和计算酿酒酵母和富硒酵母的蛋白提取效率分别达到了 8.70%和 8.35%(P>0.05),富硒酵母破碎提取物(SEYE-5668)的硒含量最高达到 3100ng/mL。
2. 不同类型的小鼠乳腺肿瘤细胞株(4T1,EMT6 和 67NR)对不同含硒化合物的敏感性存在差别,还和含硒物的浓度有关系。通过体外试验发现,本研究所得的SEYE-5668 对 3 株肿瘤细胞株的抑制作用显著强于其它含硒化合物(亚硒酸钠、L-SeC、L-SeM)(P<0.01),且在硒浓度为 0.01 μmol/L 时的抑制作用最强,而酿酒酵母破碎提取物无体外抑制作用。
3. SEYE-5668 对硒蛋白组 mRNA 的表达调控作用呈现时间剂量依赖性。
4. 通过动物实验发现,不同硒源化合物在超剂量(80 倍日常需求量)使用时均可抑制小鼠乳腺肿瘤(4T1 模型)生长的作用。对比结果显示,SEYE-5668 的抑制肿瘤生长、转移的作用最明显,且对肝脏和肺脏组织产生的副作用最小。
参考文献(略)
QQ 1429724474 电话 18964107217