基于miR-30a-5p/Hippo通路探讨莪术醇抗结直肠癌侵袭迁移的作用

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论文字数:35266 论文编号:sb2022053114050148042 日期:2022-06-22 来源:硕博论文网

本文是一篇药学论文,笔者经过研究,得出以下结论:miR-30a-5p 可以上调结直肠癌细胞中  E-cadherin、MST-1、LATS1 和 p-YAP1 的表达,降低 YAP1、β-catenin 和 MMP2 的表达,干扰Hippo/EMT 信号通路,影响癌细胞增殖及侵袭迁移能力。
1  材料与方法
1.1  实验材料
1.1.1  细胞株
人正常结肠上皮 HCoEpic 细胞购自广州吉妮欧生物科技有限公司;人结肠癌 SW620 细胞购自上海细胞库;人结直肠腺癌 HCT116 细胞,人结直肠癌 SW480 细胞以及人胚肾 293t 细胞由实验室保留所得。

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1.2  实验方法
1.2.1组织收取
(1)人 CRC 组织的获取
CRC 患者癌组织以及癌旁组织均来自桂林医学院第一附属医院。取离癌组织至少 2  cm 的相邻组织为癌旁组织。组织样本入选标准为桂林医学院第一附属医院诊断为结肠癌的且未接受药物干预的患者。这些样本收集时间为 2016 年 2 月至 2016 年 8 月。年龄在 49 岁以下占比 17.65%,在 50-69 岁之间占比 66.17%,在 70 岁以上占比 16.18%。其中男性占比36.76%,女性占比 63.24%。收集符合入选标准的患者的组织,采集组织后将 CRC 组织及癌旁组织切成小块,后置于内旋冻存管中。所有 CRC 组织均迅速冷冻在液氮中。组织由干冰运输,并在-80˚C 保存直到使用,注意中间避免反复冻融。所有样本均在患者同意并获得桂林医学院伦理委员会批准的情况下进行研究。
(2)动物肿瘤模型的构建
从上海斯莱克实验动物有限责任公司购买 16 只鼠龄约 5 周的 BALB/c无胸腺雄性裸鼠,称量裸鼠体重重量约 20  g。将裸鼠置于室温 26-28˚C,相对湿度 40-60%的实验室,每天 14 h 光照/10 h 黑暗。
复苏 HCT116 细胞,待细胞状态良好时,收集 HCT116(1×107)细胞,将其混匀于 200 μL 的 PBS 中,根据裸鼠数量计算需收集的 HCT116细胞数量。每只裸鼠接种肿瘤细胞时,采取皮下注射到右前肢侧。2 周后,当肿瘤体积达到~100  mm3时,将小鼠随机分为两组(每组 8 只)。采取灌胃给药的方式给与莪术醇(40  mg/kg/天),治疗 3 周。肿瘤体积计算公式 V=(长×宽2)/2,实验过程中允许的最大肿瘤体积为~900  mm3。采取颈椎脱位的方式室温下处死小鼠。肿瘤组织收集于 1.5  mL  EP 管中,先于液氮中迅速冷冻,后在-80˚C 保存待进一步使用。
(3)组织研磨
研磨人 CRC 组织与动物肿瘤组织,实验前所有使用物品进行烘烤,180˚C 烘烤 6-8 h。目的是保持实验操作中无 RNA 酶的污染。首先研钵中加入液氮,目的使研钵冷却。取出一定数量的肿瘤块放到研钵中,迅速研磨,研磨过程中不断加入液氮。研磨不同组织时,更换研钵。当研磨成粉末状时分装到 1.5 mL 的 EP 管中,加入 1 mL TRNZOL 进行 RNA 的提取,或者加入约 1 mL 裂解液进行蛋白的提取。
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2  结果
2.1  CRC 中 miR-30a-5p 的表达以及 Hippo/EMT 通路相关蛋白的表达
2.1.1  miR-30a-5p 在结直肠癌细胞及组织中的表达
RT-qPCR 实验检测了结直肠癌 HCT116,SW480,SW620 细胞以及结肠上皮 HCoEpic 细胞中 miR-30a-5p 的表达(图 1a)。我们发现 HCoE pic 细胞中 miR-30a-5p 的表达高于结直肠癌 HCT116,SW480,SW620 细胞中miR-30a-5p 的表达,并且 miR-30a-5p 在结直肠癌 HCT116 细胞中的表达最高,所以我们选择 HCT116 细胞进行接下来的实验。我们从临床上收集了结直肠癌及癌旁组织,组织研磨后,RT-qPCR 检测人结直肠癌组织和人结直肠癌旁组织中 miR-30a-5p 的表达(图 1b)。

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2.2  莪术醇抑制结直肠癌细胞的增殖及侵袭迁移
2.2.1  莪术醇抑制结直肠癌 HCT116 细胞的增殖
为了验证莪术醇对 HCT116 细胞的抑制能力,我们选取了不同浓度的莪术醇,分别为 0、10、20、40、80、100、120 以及 160  μg/mL 八种浓度。首先 HCT116 细胞种 96 孔板,每孔种 3000 个细胞。MTT 实验证明莪术醇以时间依赖性抑制结直肠癌 HCT116 细胞的增殖(图 3a-c),且检测出 72 h 时 HCT116 细胞的 IC50值约为 56 μg/mL。因此我们选择 50 μg/mL浓度进行后续实验。

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3 讨论 ………..……………….......45
4 结论  …………………47
3  讨论

我们的研究发现,莪术醇通过 Hippo/EMT 信号通路抑制结直肠癌HCT116 细胞的增殖和侵袭迁移。为了进一步验证莪术醇对结直肠癌的作用,我们建立了结直肠癌 HCT116 细胞裸鼠移植瘤模型。结果显示,莪术醇可以调控 Hippo/EMT 信号通路,且提高 miR-30a-5p 的表达。我们推测这可能是由于莪术醇上调了 miR-30a-5p 的表达进而影响 Hippo/EMT 信号通路。因此我们得出莪术醇抑制结直肠癌细胞的增殖及侵袭迁移与 miR-30a-5p 的表达相关。
CRC 是一种常见的高转移性胃肠道肿瘤,具有较高的死亡率[24]。转移是 CRC 患者预后不良的重要原因之一。然而,CRC 发生转移的表观遗传调控机制尚不清楚。因此,寻找新的治疗药物,探索有效的 CRC 转移治疗靶点迫在眉睫。越来越多的非编码 RNA 被确定为 CRC 预后标志物和新的治疗靶点[25-27]。miRNAs 在各种癌症中表达异常,可发挥肿瘤抑制子或启动子的作用[28,  29]。经证实,miR-30a-5p 在许多癌症中表达降低,可能是GBC 和 CRC 的一种新的潜在的预后生物标志物或分子治疗靶点[8,  30]。有研究表明 miR-30a-5p 是一种肿瘤抑制因子,通过靶向 ITGB3 抑制 CRC 细胞的迁移和侵袭,证明 miR-30a-5p 可能是一种很有效的 CRC 治疗靶点[10],但目前很少有药物,尤其是天然药物报道通过增加其表达抑制 CRC细胞转移。本研究旨在探讨 miR-30a-5p 在结直肠癌转移和分子调控中的作用,并阐明其潜在的分子机制。我们研究了莪术醇对 miR-30a-5p 表达和CRC 细胞迁移侵袭的潜在影响。我们建立了结直肠癌异种移植瘤模型,RT-qPCR 实验表明莪术醇可以上调 miR-30a-5p 和 E-cadherin 的表达,抑制β-catenin 和 MMP2 的表达。
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4  结论
(1)莪术醇在体内外抑制结直肠癌 HCT116 细胞的增殖及侵袭迁移。
(2) 莪术醇可以上调结直肠癌细胞中 E-cadherin、MST-1、LATS1 和 p-YAP1 的 表 达 , 降 低 YAP1 、 β-catenin  和   MMP2 的 表 达 , 影 响Hippo/EMT 信号通路。
(3)miR-30a-5p 可以上调结直肠癌细胞中  E-cadherin、MST-1、LATS1 和 p-YAP1 的表达,降低 YAP1、β-catenin 和 MMP2 的表达,干扰Hippo/EMT 信号通路,影响癌细胞增殖及侵袭迁移能力。
(4) 莪术醇可以通过 miR-30a-5p 干扰 Hippo/EMT 信号通路,最终抑制结直肠癌细胞的增殖及侵袭迁移。
参考文献(略)


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