重组人血小板生成素注射液在猕猴体内的药代动力学及药效动力学探讨

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论文字数:49666 论文编号:sb2022031022231144774 日期:2022-03-21 来源:硕博论文网
本文是一篇药学论文参考,本论文以三生制药有限责任公司生产的由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达的经提纯而制得的全长糖基化的 rhTPO 注射液为研究对象,首先,对猕猴血清样品中 rhTPO 含量测定的 ELISA 分析方法进行方法学确证。其次,对其在健康猕猴及辐射猕猴体内的药代动力学特征进行研究,在健康猕猴体内比较皮下及肌肉注射这两种给药方式的相对生物利用度,在辐射猕猴体内给予不同剂量,研究其是否像皮下注射的文献报道一样,也是线性动力学,并且与健康猕猴体内的药代动力学特征进行对比。

第一章 绪论

1.1 引言
1958  年,Yamamoto[1]  首先提出了一个假设:人体血液中的血小板水平是由某一未知的特定的作用于巨核细胞的体液因子来进行调节的。同年,这种未知的体液因子被匈牙利科学家 Kelemen[2]命名为血小板生成素(thrombopoietin, TPO)。经过三十多年的努力,直到 1994 年,几个研究小组采用反相或常规生物技术,才从不同样本中几乎同时纯化得到了细胞因子受体-c-mpl 配体(即TPO)[3]。在过去的几十年中,国内外学者对 TPO 进行了大量的研究,生理研究表明,血小板是由骨髓巨核细胞产生的,该骨髓巨核细胞起源于具有自我更新能力的多能造血干细胞定向分化而成的巨核细胞祖细胞[4],巨核细胞通过增加血小板的数量、大小和 DNA 倍性来对血小板减少症作出反应[5],TPO 是巨核细胞增殖、分化、成熟和介导血小板产生的最主要的内源性调节因子[6-7],TPO刺激了巨核细胞集落形成细胞的能力,并增加了巨核细胞的数量,大小和倍性。
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1.2 血小板生成素的研究进展
1.2.1 TPO 的论述
TPO,又称为巨核细胞生长和发育因子(MGDF)、c-mpl 的配体、巨核细胞集落刺激因子(MK-CSF),它是一种由 332 个氨基酸残基组成的分子量约为 60-70 kDa 的糖基化多肽,为 c-mpl 受体的配体,具有特异性地刺激巨核系祖细胞增殖与分化、促进巨核细胞成熟的活性[9-12]。它主要产生于肝脏、肾脏,脑、骨骼肌、肠、脾、骨髓等部位,从胎儿到成年,肝细胞持续表达,且 TPO mRNA 的表达从胚胎时期到成熟没有差别,血清游离 TPO 浓度是通过粘附于表达在血小板和巨核细胞上的 c-mpl 受体来调节的[13-14]。亦有研究证明,TPO 在全身各器官均有表达,在急性血小板减少症和增多症中,血清 TPO 不是通过TPO 基因表达,而是通过骨髓和脾脏中的巨核细胞数和循环中的血小板数来调节的[15]。
“血小板生成素”的概念在 1958 年首次进入医学文献,当时 Kelemen[2]提出,必须存在一种造血生长因子,会像促红细胞生成素(EPO)调控红细胞生成相同的方式来调节血小板的生成。不幸的是,他最初对 TPO 的概念是错误的。他的假设是,TPO 是血小板减少性骨髓增生性疾病患者血浆中存在的物质,这刺激了血小板计数的增加,而不是血小板减少过程中出现的因子。直到 1959 年Rak[16]等人研究了一个病例,这个患者血小板计数在 10000-30000 之间,骨髓巨核细胞贫乏;1963 年,Kelemen[17]等人具有更大的实验基础时,Kelemen 教授对于 TPO 的概念才被修改为血小板减少血浆中的循环因子,从而刺激了血小板生成的增加并加速了血小板减少的恢复。
1.2.2 TPO 的提取纯化
自 1958 年发现了血小板生成素后,研究者们对其进行了大量的纯化实验研究,使用来自血小板减少性动物的尿液或血浆,或来自人类胚胎肾脏(HEK)细胞的条件培养基,采用尚未验证的多种生物测定方法试图纯化 TPO。尽管这些实验室进行了超过 35 年的艰苦努力,但仍无法使用与成功纯化促红细胞生成素(EPO)相当的技术来纯化造血生长因子[18]。
在1958 年至 1994 年之间,发现了许多其他造血生长因子并确定了它们的特征。其中包括白介素 3(IL-3),白介素 6(IL-6),白介素 11(IL-11)和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)等。而 IL-11 中的一种会增加接受化疗的动物和人类的血小板计数,是迄今为止美国食品和药品监督管理局(FDA)批准的唯一一种用于化学疗法诱发的血小板减少症的细胞因子[19]。然而,由于其毒性,部分患者表现出水肿、呼吸困难、心律不齐和晕厥等症状,从而限制了其在临床上进一步的推广和使用  [20]。IL-11 是第一个重组促血小板生成的药物,尽管如此,IL-11 并不是真正的 TPO,1998 年 Robb[21]等人发现在缺乏 IL-11 的动物中血小板计数正常。最后,Tayrien[22]等人与 1987 年的一份报道中描述了从 HEK 细胞的条件培养基中纯化巨核细胞刺激因子(MSF),从而增加了原核成核细胞系中血小板因子的合成。不幸的是,在此报道发表后不久,作者探索了 MSF 的特征,并意识到它不具有使其成为血小板生成的生理调节剂的任何特性。
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第二章 猕猴血清样品中 rhTPO 含量测定的 ELISA 分析方法的建立和确证

2.1 实验材料
2.1.1 主要药品和试剂
受试药物:重组人血小板生成素注射液,由委托单位沈阳三生制药有限责任公司提供;规格:15000  U·mL-1,每瓶装量 1.0  mL;浓度:50  mg·mL-1;批号:201907070;储存:密封 2-8°C 干燥保存。 试剂:R&D 试剂盒(美国 R&D Systems 公司),批号 P223429、P242881;去离子水。
2.1.2 主要仪器和设备
可调式混匀仪(MX-S,美国 SCILOCEX 公司);Milli-Q 超纯水系统(A10,美国 Millipore 公司);超低温冰箱(MDF-192,日本 SANYO);海尔冷藏柜(BCD-256KF,青岛海尔股份有限公司)。 
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2.2 实验方法
2.2.1 标准曲线及质控样品的制备
用混合猕猴血清将 rhTPO 注射液进行稀释,得到 31.25、62.5、125、250、500、1000、2000  pg·mL-1 的标准样品。用相同方法制备独立于标准样品的质量控制样品,分别为 80 pg·mL-1 (低),400 pg·mL-1 (中) 和 1600 pg·mL-1 (高)。
2.2.2 血清 rhTPO 浓度的测定
用 美 国 R&D  Systems 公 司 生 产 的 Quantikine®  ELISA  Human Thrombopoietin  Immunoassay  DTP00B 试剂盒,ELISA 夹心酶联免疫吸附法测定血清中 rhTPO 浓度。
2.2.3 测试原理
ELISA 夹心酶联免疫吸附法:微孔板预包被 TPO 特异性重组人 TPO 单抗,加入血清样品或标准品孵育。TPO 与固定在微孔板上的特异性抗体结合。洗涤除去过量的血清或标准品后,每孔加入重组人 TPO 单抗-辣根过氧化酶结合物,再孵育,抗体酶结合物与固定板上 TPO 结合,洗涤除去过量结合物。加显色剂,酶反应氧化形成蓝色复合物,加酸终止反应,颜色转黄,成色量与 TPO 抗体复合物结合物量成正比,与血清或标准 TPO 量成正比。复合物吸光率和标准 TPO浓度绘制标准曲线,计算未知样品浓度。
2.2.4 测定步骤
使用前将所有试剂和样品置于室温下 20-30 min。复孔测定所有标准品、样品和对照品。
从板框上除去多余的微孔板,将其返回到含有干燥剂包的箔袋中,重新密封。
每孔中加入 50 μL Assay Diluent RD1-1。
每孔加入 200 uL 的标准品、对照品或样品。用提供的胶条覆盖,室温下孵育 3 小时。
抽吸清洗每个孔,重复该过程 3 次,共进行 4 次清洗。在每个孔中加入清洗缓冲液(400  μl)进行清洗。在每个步骤中彻底清除液体对于确保良好性能至关重要。最后一次清洗后,通过抽吸或倾倒除去所有剩余的洗涤缓冲液,倒置板并用干净的纸巾吸干。
孔中加入 200 μl Human Tpo Conjugate。盖上新的胶条,室温孵育 1 h。
重复步骤 5 中的清洗步骤。
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第三章  健康猕猴单次皮下注射或肌肉注射 rhTPO 后的药代动力学研究及外周血象测定 .................... 19
3.1 实验材料 ............................................ 19
3.1.1 主要药品与试剂.................................. 19
3.1.2 主要仪器与设备.............................................. 19
第四章  辐射猕猴单次肌肉注射不同剂量 rhTPO 后的药代动力学研究及外周血象测定 ..................................... 40
4.1 实验材料 ................................ 40
4.1.1 主要药品与试剂............................. 40
4.1.2 主要仪器与设备........................................ 40
第五章 结论与展望 ......................... 61

第四章 辐射猕猴单次肌肉注射不同剂量 rhTPO 后的药代动力学研究及外周血象测定


4.1 实验材料
4.1.1 主要药品与试剂
rhTPO 注射液,批号:201907070,来源:沈阳三生制药有限责任公司;R&D 试剂盒,批号:P275307,来源:美国 R&D Systems 公司。
4.1.2 主要仪器与设备
本实验使用的主要仪器与设备如表 4.1 所示。
药学论文参考
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第五章 结论与展望


本论文以三生制药有限责任公司生产的由中国仓鼠卵巢细胞(CHO)表达的经提纯而制得的全长糖基化的 rhTPO 注射液为研究对象,首先,对猕猴血清样品中 rhTPO 含量测定的 ELISA 分析方法进行方法学确证。其次,对其在健康猕猴及辐射猕猴体内的药代动力学特征进行研究,在健康猕猴体内比较皮下及肌肉注射这两种给药方式的相对生物利用度,在辐射猕猴体内给予不同剂量,研究其是否像皮下注射的文献报道一样,也是线性动力学,并且与健康猕猴体内的药代动力学特征进行对比。在药代动力学实验的同时观察外周血中各血细胞的变化,分析 PD-PK 相关性,所得主要结论如下:
(1)对于大分子生物样品,由于其复杂的生物学结构,使其难以被提取,所以常常在无预先分离的情况下测定分析物,而质谱方法对分析物的纯度要求较高,因此采用主要用于大分子药物的配体结合分析方法来测定 rhTPO。方法学验证结果为:标准曲线:范围为  31.25  pg·ml  -1-  2000  pg·ml  -1,定量下限为 31.25 pg·ml -1,定量上限为 2000 pg·ml -1,在此范围内标准曲线呈现良好的线性。精密度与准确度:批内精密度 RSD 为 3.1~5.4%,批间精密度 RSD 为 5.1~18.5%,准确度 RE 为-10.6~7.9%。稀释线性:rhTPO  血清样品用相同基质稀释后测定不会产生稀释效应。平行性:真实  rhTPO 血清样品各稀释度之间的精密度满足药典要求。稳定性:经验证血清样品室温 3h 稳定性、-20 ℃冻存 7 个半月长期稳定均符合药典的要求。特异性:rhTPO  血清样品与雌三醇联合用药无明显的交叉反应。经验证此法的定量下限、精密度与准确度、稀释线性、平行性、稳定性及特异性能够满足猕猴血清样品中 rhTPO 的定量分析要求,该方法简单、易于操作、灵敏度高、特异性强、准确度好,适合用于 rhTPO 在猕猴体内的定量分析。
(2)在健康猕猴体内研究皮下及肌肉注射这两种给药方式的药代动力学特征,比较这两种给药方式的相对生物利用度。皮下注射 sc 与肌肉注射 im 相比,体内消除半衰期 t1/2 分别为 15.00±2.40h 和 16.01±3.29h、达峰时间 Tm  分别为5.33±2.07h 和 4±1.07h、平均滞留时间 MRTlast分别为 14.71±2.34h 和 13.63±1.83h,并没有明显区别,差异并无统计学意义,相对生物利用度 im/sc=394.34%。差异显著,说明 rhTPO 肌肉注射生物利用度更高,吸收更好。在药代动力学实验的同时测定了外周血中各血细胞计数的变化,发现在健康猕猴体内 rhTPO  的作用呈单系特异性,即仅对外周血中血小板计数具有明显的升高作用,其它血细胞计数并无明显的变化。
参考文献(略)


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