齐墩果酸衍生物的合成及初步抗肿瘤活性思考

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论文字数:33566 论文编号:sb2022022716533244298 日期:2022-03-09 来源:硕博论文网
本文是一篇药学论文,在实验过程中,将 OA 骨架中 C-3 位羟基氧化时,氧化剂的选择至关重要,选用 Jones 试剂作为氧化剂,因为齐墩果酸母核存在双键,相比于 PDC 试剂,Jones试剂是相对弱的氧化剂,不会破坏其他部位结构且最终产物收率较高,而且 Jones试剂配制方法以及后处理比较简单,易于实验室的常规操作,同时节省了反应时间,所以它是最好的氧化剂。

第一章 文献综述

1.1 齐墩果酸的研究进展
1.1.1 齐墩果酸简介
齐墩果酸(Oleanolic acid,简称 OA)是一种五环三萜类化合物[7],以游离或组合糖苷的形式存在于自然界的各种植物中,包括夏枯草、孕牛漆、灌木胆等植物[8]。研究表明,齐墩果酸及其衍生物具有广泛的药理活性,主要有保肝抗炎、降血糖血脂、抗病毒和抗肿瘤等[9-13],是具有发展潜力的先导化合物。其结构式如图 1-1 所示:
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1.2 齐墩果酸及其衍生物的药理活性
1.2.1 齐墩果酸的抗肿瘤活性
Amara S 等[14]研究报道了 OA 在渗透压诱导的乳腺癌生长过程中逆转糖酵解酶的表达,而糖酵解酶之前在高渗状态下增强,这种逆转有效地减少了癌细胞的增殖。卫小红等[15-16]研究发现对人肺癌细胞,以 5.40 mg/L 浓度的齐墩果酸溶液进行培养,人肺癌细胞生长受到抑制,研究发现齐墩果酸抑制癌细胞进行有丝分裂,阻碍细胞G1 期的转化,诱导肿瘤细胞凋亡,这与细胞内 Ca2+浓度存在一定关系。Wang B, ZeiselMB, Zhao X 等[17-19]研究发现 miR-122 是某些肿瘤抑制因子,在 OA 抗肿瘤作用的另一种特异性机制被认为是诱导 miR-122 的过表达,60 μg/mL OA 处理 8h 后,肺癌细胞中 miR-122 的表达可达 9.9 倍,结果表明齐墩果酸可以抑制肺癌细胞的增殖。WangX 等[20]研究报道了齐墩果酸在不同的体外和体内模型中对肿瘤生长的抑制活性,研究发现 OA 能抑制小鼠移植瘤的生长和肝癌细胞 HepG2 的增殖,这表明 OA 的抗肿瘤活性是通过上调肿瘤蛋白(p53)、环氧化酶-2(COX-2)实现的介导的线粒体凋亡途径活化和细胞周期阻激活以及细胞周期阻滞。
Liese J 等[21]在人肝癌细胞中,通过模拟 BV6 和 OA 的组合,使用线粒体来源的激活剂(SMAC)组合来治疗人肝癌细胞,证实 OA 通过线粒体途径诱导肝细胞凋亡,并调节 erk-p53 介导细胞周期的终止。Wang 等[22]研究发现西兰花中含有一种天然抗癌化合物萝卜硫素,它和 OA 的药物组合物能抑制人肝癌细胞 HepG2 和大鼠肝癌细胞 RH-35 的生长,在 HepG2 细胞构建的小鼠转移瘤中,该组合具有协同的抗肿瘤机制,且比其它药物单独使用更有疗效。
Wei 等[23]报道 OA 抑制胰腺癌 Panc-28 细胞的生长,并通过 ROS 介导的线粒体途径诱导细胞凋亡。Lin 等[24]研究发现 OA 能用于治疗结肠癌的药物组合物,OA 对人结肠癌细胞 HTC-116 的 IC50 值为 17.3 μmol·L-1,且裸鼠体内实验表明,OA 比 5-氟尿嘧啶抑制率高。Niu 等[25]通过 MTT 法测定人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的增殖,并通过伤口愈合法、穿孔迁移法和血管形成法测定其侵袭和迁移。使用异种移植小鼠模型来研究 OA 在体内阻断血管生成的作用,通过 Western 印迹用于检查VEGFR-2 的磷酸化,结果表明,OA 可减轻 HUVEC 的侵袭、迁移、血管形成和血管生长,此外,OA 还可以抑制 HUVEC 的生长和形成。最重要的是,无论在体内还是体外,OA 都能阻断 HUVEC 和结直肠癌细胞(HCT-116)中的血管生成,通过阻断血管内皮生长因子受体 VEGFR-2 的磷酸化介导的 OA 依赖性肿瘤血管生成抑制,从而抑制 MEK / ERK / JNK 途径。
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第二章 齐墩果酸衍生物的设计

2.1 基于 VEGF 受体蛋白靶酶结构的计算机辅助药物设计
计算机辅助药物设计(Computer-aided drug design,CADD)是一种通过计算机模拟和预算药物受体关系来设计和优化先导化合物的方法,该方法能极大的提高药物筛选的效率。近年来,我们课题组主要从事对五环三萜类化合物构效关系的研究,通过 CADD 筛选生物活性片段,根据药效团识别和化学 link-拼接原理对其结构进行优化,有望提高五环三萜类似物抑制癌细胞活性[102-108]。
肿瘤血管生成是癌细胞发生转移的前提,VEGF 是血管内皮生长因子,在肿瘤血管生成这一过程中,它起到推进的作用。因为当组织处于正常状态时,血管内皮生长因子的表达能力比较差,一旦组织中有要生成的血管时,血管内皮生长因子将会极大的诱导肿瘤血管的生成,起到很强的促血管生成作用,所以,抑制 VEGF 表达研究抗肿瘤药物具有重要意义[109]。
由辉瑞公司研制的肾癌新药阿昔替尼,它是一种靶向 VEGFR 受体抑制剂,这个新药化学结构上主要有肼基和胺基基团,通过有效作用于 VEGFR 受体或其他靶点,减缓酪氨酸激酶磷酸化过程,防止其与蛋白分子的结合,最终达到阻断细胞内信号传导的目标[110-112]。我们结合 PDB 数据库中 VEGFR 受体的三维晶体结构(PDB 编号:5ew3),将以 VEGFR 为受体的小分子抑制剂阿西替尼与靶酶进行模拟分子对接,解析 Axitinib 与其作用形式,得到关键的氨基酸残基,并确定 Axitinib 中与关键氨基酸结合的活性基团或结构片段(如图 2-1),将这些活性基团设计到齐墩果酸母核中,形成新型衍生物的结构设计思想(如图 2-2)。最后设计并合成了三类新型齐墩果酸类衍生物(如图 2-3)。
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2.2 构建靶向 VEGFR 受体抑制剂
2.2.1 构建 VEGFR 受体抑制剂的药效团模型
使用 MVD 6.0(Molegro Virtual Docker)分子对接软件,打开 VEGFR 受体蛋白,(PDB Code:5ew3)选择 Docking Wizard 确定 VEGF 靶蛋白 Activity Cente 区域位置,使用 ChemDraw 3D 12.0 构建 OA 的 3D 构象,并存贮为 mol2 文件格式,将 mol2文件替换 VEGF 靶蛋白原有配体,与活性区域位置进行半柔性对接,靶蛋白构象不变,选择打分函数 MolDock Score[GRID]与构象搜寻 MolDock SE,得到相应的分子对接分数(Mol Dock Score=-97.04)。将阿西替尼用相同的方法与 VEGF 靶蛋白(PDBCode:5ew3)进行对接,得到分子对接分数(Mol Dock Score = -121.450)。
对接完毕后,将会得到得到各个化合物与蛋白受体的得分情况(见表 2-1)以及一系列化合物优化后的结构文件。相应的对接文件用 Discovery studio 4.0 软件解析后得到化合物与 VEGF 靶蛋白的对接立体与平面图像(如图 2-4、2-5、2-6)。根据对接数据解析发现阿西替尼与所设计的化合物与 VEGFR 的对接分数明显高于齐墩果酸,说明 OA 与 VEGF 靶蛋白具有一些键能相结合,但其结合性能较差。但阿西替尼和所设计化合物其与 VEGF 靶蛋白结合较好,使用 Discovery studio4.0 软件解析后,发现所有化合物均通过氢键、疏水键和范德华力等与 VEGFR 靶蛋白氨基酸残基相结合(其中关键氨基酸包括:TYR1136、ARG1126、ALA1127、LEU1140、ARG1124等),尤为重要的是,在化合物的酰胺片段上,每种类型化合物同临床抗癌药物阿西替尼药物一致,均与氨基酸残基 TYR1136 以氢键的方式相连,这对药物的活性判断,起到关键性的作用。
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第三章 目标化合物的合成路线.................................22
3.1 齐墩果烷并[3,2-c]吡唑-12-烯-28-酰胺类化合物的合成路线...........................22
3.2 3-苯甲酰亚肼基-齐墩果烷-12-烯-28-酰胺类化合物的合成路线......................22
3.3 齐墩果烷并[3,2-c]异噁唑-12-烯-28-酰胺类化合物的合成路线.......................23
第四章 实验部分.....................................24
4.1 实验药品与仪器..................................24
4.1.1 实验药品..............................................24
4.1.2 实验仪器......................................24
第五章 实验结果与讨论..............................32
5.1 实验结果..................................................32
5.2 化学实验.........................................32

第五章 实验结果与讨论

5.1 实验结果
本课题结合计算机辅助药物设计,以 OA 为母核,对其 A 环、C-28 位进行结构修饰,设计并合成了三类共 12 个齐墩果酸类衍生物。包括齐墩果烷并[3,2-c]吡唑-12-烯-28-酰胺类化合物、3-苯甲酰亚肼基-齐墩果烷-12-烯-28-酰-胺类化合物,和齐墩果烷并[3,2-c]异噁唑-12-烯-28-酰胺类化合物。所合成化合物经 1H-NMR 谱图解析确定其化学结构。采用 MTT 法,选用人肝癌细胞(HepG2)、乳腺癌细胞(MCF-7)对目标化合物进行初步体外抗肿瘤活性测试。
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第六章 结论


1、本文以天然产物齐墩果酸为母体,使用计算机辅助药物设计进行化合物的筛选,合成出三类共 12 个未见文献报道的齐墩果酸衍生物,分别为:4 个齐墩果烷并[3,2-c]吡唑-12-烯-28-酰胺类化合物、4 个 3-苯甲酰亚肼基-齐墩果烷-12-烯-28-酰胺类化合物和 4 个齐墩果烷并[3,2-c]异噁唑-12-烯-28-酰胺类化合物,均未见文献报道,其结构通过1H-NMR 谱图解析确认。
2、在实验过程中,将 OA 骨架中 C-3 位羟基氧化时,氧化剂的选择至关重要,选用 Jones 试剂作为氧化剂,因为齐墩果酸母核存在双键,相比于 PDC 试剂,Jones试剂是相对弱的氧化剂,不会破坏其他部位结构且最终产物收率较高,而且 Jones试剂配制方法以及后处理比较简单,易于实验室的常规操作,同时节省了反应时间,所以它是最好的氧化剂。
3、将多种芳香胺分别引入齐墩果酸 C-28 位时需要加入适量的 DMAP 和吡啶作为亲核酰化催化剂,能缩短反应时间并提高收率。
4、在将羟亚甲基引到 C-2 位,选择甲苯为溶剂、叔丁醇钾为催化剂时,得到的产物产率较高。
5、体外抗肿瘤活性试验结果表明,所有化合物对人肝癌细胞 HepG2、乳腺癌细胞 MCF-7 都有一定的抑制作用,并得出了实验范围内初步的构效关系。三类化合物对两种癌细胞的抑制率分别为 I3>I2>I1>I4,II2>II4>II1>II3,III4>III3>III1>III2,在 A 环引入吡唑环、异噁唑环和在 C-3 位引入苯甲酰亚肼基,C-28 位羧基引入对氯苯胺、对硝基苯胺、间甲氧基苯胺,所得化合物表现出更好活性,对人肝癌细胞(HepG2)和乳腺癌细胞(MCF-7)的抑制率 I3>II2>III4。结果表明在 C-28 位引入吸电子基芳香胺时,A 环引入吡唑环与 A 环引入异噁唑环相比,吡唑环对齐墩果酸衍生物的抗肿瘤活性更强;在 C-3 位引入苯甲酰亚肼基时,C-28 位引入供电子基芳香胺更有利于齐墩果酸衍生物的抗肿瘤活性。
参考文献(略)


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