儿童下呼吸道感染样本IFITMs基因药学差异表达分析

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论文字数:37485 论文编号:sb2018030118204119824 日期:2018-06-08 来源:硕博论文网
摘要:本文是药学论文,药学专业业务培养要求:本专业学生主要学习药学各主要分支学科的基本理论和基本知识,受到药学实验方法和技能的基本训练,具有药物制备、质量控制评价及指导合理用药的基本能力。(以上内容来自百度百科)今天硕博网为大家推荐一篇药学论文,供大家参考。
 
第一章 前 言
 
1.1 呼吸道感染
呼吸道感染一直是全球公共卫生的主要负担。特别是急性呼吸道感染(Acuterespiratory infection,ARI),全球近二百万的儿童死亡病例是由于 ARI 导致的[1]。埃及有数据表明[1],在对 2009 年 6 月 23 日至 2013 年 12 月 31 日之间的 6113 例、年龄>1 个月的疑似 ARI 的患者检测中,发现病毒性病原体感染者的比例,随着年龄的增长而减少(从 1 岁 11 个月的患者 67%至≥65 岁患者占 19%)。1 岁以上患者中流感是主要的病毒性病原体。在 1-11 个月的儿童中 ARI 发病率最高(1757.9–5537.5/100 000 人口),其中呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus ,RSV)是在这个年龄组检测出的最常见的病原菌。呼吸道以喉中环状软骨为界分为上下两部分,以上称为上呼吸道,下则成为下呼吸道。呼吸道感染分为上呼吸道感染和下呼吸道感染。呼吸道感染的病原菌检测可以通过鼻咽抽吸物及肺泡灌洗液进行分析。张新星等[2]研究发现呼吸道感染病原检测中,鼻咽抽吸物与肺泡灌洗液联合检测的病原总阳性检出率大于单个检测的结果。其中肺泡灌洗液病毒检出率大于鼻咽抽吸物的病毒检出率,细菌阳性检出率无差异。但也有报道称肺泡灌洗液细菌阳性检出率大于鼻咽抽吸物,这可能与不同的地理环境等因素有关。上呼吸道感染的主要病原体为呼吸道合胞病毒、腺病毒(adenovirus ,ADV)和副流感病毒(parainfluenza virus,PIV)、流感病毒(influenza virus,IVA)等[3, 4]。李静等[5]在研究吉林省 2011 年-2014 年上呼吸道感染后发现主要以流感病毒、腺病毒和呼吸道合胞病毒为主。病原体的分布与环境、时间和患者的年龄等因素有关。亓晓等[6]研究表明 5 岁以下的儿童上呼吸道病毒性感染率较高,这可能与儿童抵抗力弱有关。呼吸道病毒感染患者中病毒可改变鼻咽部的细菌的分布,但两者之间具体是怎么相互影响的还有待研究。孙黎黎等[7]研究发现上呼吸道感染样本中细菌培养的阳性率为 32.7%,其中革兰氏阳性菌占 39.7%,革兰氏阴性菌占 61.2%。在其研究发现的主要病原菌金黄色葡萄球菌种有 61.1%是对头孢西丁产生了耐药性。
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1.2 干扰素诱导的跨膜蛋白(interferon inducible transmembraneproteins,IFITM)简介
干扰素(interferon,IFN)是 Isaacs 等[9]1957 年研究流感病毒在鸡胚绒毛尿囊膜中的受干扰因素时发现的一组通过宿主细胞产生的低分子糖蛋白。它按照其受体不同可以分为   型和Ⅱ型。  型包括 IFN-α,IFN-β 和 IFN-ω 等,Ⅱ型仅包括 IFN-γ[10]。IFN 具有抗病毒效应,在受到入侵时细胞内的 Toll 样受体识别并递呈病原体相关分子模式( pathogenassociated molecular patterns,PAMP) ,启动 Toll 样受体信号转导途径,激活转录因子,进而激活特定的细胞因子和趋化因子的表达,使机体处于抗感染状态[11]。其中最主要的细胞因子就是 IFN。IFN 相关基因从常规状态下转化为活化状态后,与目的细胞上的 IFN 受体结合,诱导细胞表达可以启动或调节机体免疫应答的干扰素刺激基因(Interferon stimulated genes,ISGs),而 ISGs 调控表达的产物中较为重要的一类就是干扰素诱导跨膜蛋白(interferon inducible transmembrane proteins,IFITM)[12]。IFITM 家族成员有不同的功能,包括控制细胞的增殖和促进同型黏附[13],预防病毒感染和骨基质矿化成熟[14],调节生殖细胞发育[15]等 。人类IFITM家族包括5个基因,分别是IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM10,均位于 11 号染色体上。不同于人类,小鼠还包括 IFITM6 和 IFITM7 基因,除 IFITM7位于 16 号染色体外,其它基因均位于 7 号染色体。IFITM1 是由白细胞和内皮细胞表达,具有促进增殖和同型黏附等作用。在许多细胞系中,IFITM2 诱导细胞周期阻滞和随后p53 依赖的细胞凋亡。IFITM3 具有促进细胞增殖的作用,作为机体免疫屏障,IFITM1、IFITM2 与 IFITM3 在抵抗呼吸道病毒入侵过程中发挥着重要作用。近些年,陆续有它们作为多种肿瘤标记物[16]或是在肿瘤组织中过表达以及相关信号通路[17]的报道。IFITM5是骨限制性 IFITM 样蛋白,在人类和小鼠的骨中限制性表达,尤其是在成骨细胞中[18],该基因定点突变会导致 V 型成骨不全的发生[19],突变体的过表达能够促进 Saos2 成骨细胞的凋亡[20]。IFITM6 在荷瘤小鼠的脾脏巨噬细胞中强诱导表达[21]。IFITM10 按水生和陆生脊椎动物可分为两个亚型,可能与水环境的适应性有关,且该基因同 CTSD 一起可以作为乳腺癌分子标记物[22]。IFITM7 功能尚无报道。
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第二章 儿童下呼吸道感染样本 IFITMs 基因差异表达分析
 
2.1 实验方法
儿童下呼吸道感染患者肺泡灌洗液样本取自济南市儿童医院检验科。共采集样本320 例,男性 194 例、女性 126 例,平均年龄为 2.80(±2.93)岁,其中小于 1 岁的患者占 34.38%。呼吸道感染临床分类按照支原体肺炎与非支原体肺炎;轻症肺炎与重症肺炎;支气管肺炎与重症肺炎;肺炎并肺不张与非肺不张进行分类。同时统计血常规检查中白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白计数和血小板计数等各项数据。根据实验室前期研究结果,统计各肺泡灌洗液样本中包括流感病毒、呼吸道合胞病毒人副流感病毒、人腺病毒、人偏偏肺病毒、人冠状病毒、人博卡病毒、人鼻病毒和人肠病毒等共 9 种呼吸道病毒以及 11 种亚型的检测结果,临床细菌感染结果,并与后续的 IFITMs 家族成员的基因表达进行相关性分析。应用 One Step SYBR PrimeScript PLUS RT-PCR Kit,反应体积为 10 μl,每个反应加2xOne Step SYBRRT-PCR Buffer 5μl;PrimeScript RNase 0.2 μl; Mix TaKaRa Ex Taq HSMix 0.6 μl;上游、下游引物(10 μM)均为 0.5 μl;模板 RNA 20 ng;RNase- free ddH2O,补充到 10 μl。每一个样本中 IFITMs 及内参 GAPDH 均有 3 个平行反应。
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2.2 结果
统计按年龄分组分别统计分组中的频数分布(表 3)。组别包括肺炎并肺不张及非肺不张,支原体感染与非支原体感染,支气管肺炎、轻症肺炎和重症肺炎组,血常规检测中白细胞计数、红细胞计数、血小板计数和血红蛋白计数中的。IFITMs 家族不同基因引物的扩增 Ct 值、以及筛选后每个基因最扩增 Ct 值分别出现在引物 IFITM1-3、IFITM2-2、IFITM3-2、IFITM5-6 和 IFITM10-2(表 2),其 CT 值分别为 24.10±0.10、28.72±0.12、27.69±0.11、24.96±0.11 和 24.22±0.10。分析 IFITMs 在感染与未感染某病毒的样本之间的统计学意义(见表 6)。IFITM1在感染冠状病毒和未感染冠状病毒的样本之间,IFITM3 在感染和未感染 hCov-OC43 病毒的样本之间,有显著性差异,具有统计学意义。IFITM3 在感染流感病毒和未感染流感病毒的样本之间,IFITM1 和 IFITM2 在感染和未感染 IBV 病毒的样本之间,IFITM3在感染和未感染 IAV 病毒的样本之间,差异均有统计学意义。IFITMs 其它成员在感染与未感染某病毒样本之间无统计学意义。
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第三章 大鼠 IFITMs 基因组织表达图谱 .........33
3.1 材料与方法............. 33
3.1.1 实验仪器和试剂...... 33
3.1.2 实验试剂....... 33
3.2 实验方法...... 34
3.2.1 大鼠 IFITMs 系统进化树和蛋白序列同源性图分析 ............. 34
3.2.2 大鼠组织获取及 RNA 提取 ......... 34
3.2.3 大鼠 IFITMs 引物设计与优化 ..... 35
3.2.4 RT-qPCR ........ 36
3.2.5 3%琼脂糖凝胶电泳验证 PCR 扩增的特异性 .... 37
3.2.6 数据分析....... 38
3.3 结果.............. 38
3.3.1 大鼠 IFITMs 蛋白同源性比对及系统进化树分析 ...... 38
3.3.2 引物筛选....... 39
3.3.3 大鼠 IFITMs 基因组织表达图谱 ............ 41
3.4 讨论.............. 47
 
3.4 讨论
 
IFITM 蛋白是干扰素诱导的一类蛋白,在细胞增殖、粘附和机体免疫等过程中发挥着重要作用。IFITM 家族在大鼠中共 7 类,IFITM1、IFITM2 和 IFITM3 与机体的在机体免疫过程中发挥着不可获取的作用,Tanaka 等[130]人研究表明原始生殖细胞发育过程中的表达 IFITM1、IFITM2 和 IFITM3 具有差异性。IFITM5 与骨中的钙盐沉积有关。Smith等[14]人的研究中发现 IFITM6 表达更受的巨噬细胞限制。IFITM6、IFITM7 和 IFITM10的作用还未揭示清楚。本实验通过观分析 IFITMs 在 mRNA 上的表达差异,观察在大鼠不同组织中的表达图谱,旨在为揭示 IFITMs 更明确的功能提供一种思路。IFITM1、IFITM2 和 IFITM3 是天然免疫系统的主要组成部分,Bailey 等[30]人指出IFITM3 在气道和脏胸膜的上皮细胞中表达,在其它位置表达少,而 IFITM1 和 2 在体内其它位置表达少。虽然本实验中发现肺与气管的表达量无显著差异,在其他组织中也有分布,如 IFITM2 和 IFITM3 在皮肤中的表达量明显高于其它组织。IFITM1、IFITM2 和IFITM3 在其它组织中表达也有分布的现象不容忽视,这与 Michael 等[76]人研究的IFITM1、IFITM2 和 IFITM3 在人体中广泛表达的描述一致。有趣的是,IFITM7 与 IFITM2组织表达特征的趋势类似,但是这种分布规律的原因还未跟踪到文献。在 IFITM5 的表达图谱中发现除了在骨骼中有分布,如骨髓、皮肤、胰和平滑肌等组织中均在 mRNA 水平上检测到了表达,这与文献中描述 IFITM5 仅在骨骼中表达不一致,而骨特异性表达适用于特定的哺乳动物[18]。IFITM5 不同的物种中的组织表达特异性不同,有报道称[131]在斑马鱼中,与 IFITM5 不在骨中表达,而在脑、肌肉和肝脏中表达。在鸡表达标签数据库中发现骨中发现骨中没有 IFITM5 的分布,但是发现在肝、肌肉和脾中高表达,在大脑和卵巢中低表达[132]。因此,IFITM5 在骨骼中的相对表达量存在物种差异。
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结论
 
RAW264.7 和骨髓是表达 IFITM6 基因的主要场所[14]。虽然脾脏中含有大量的巨噬细胞,本文中发现脾脏中的 IFITM6 的表达量并不高,这种现象还未得到解释。另外IFITM6 在眼睛中的表达量明显高于其他组织,胰腺、胆囊中也有表达,在骨骼中的表达比较广泛,而在生殖相关组织中表达及极低。Danielle 等[131]报道称 IFITM10 在小鼠脑、脾脏中表达,在小鼠骨骼中不表达。Okuzaki Y 等[133]人研究发现 IFITM10 在 2.5 天鸡胚胎原生殖细胞中高表达 IFITM10,然后随着时间推移慢慢减少。本文中发现除了脾脏和脑组织中,如食管,气管、骨、平滑肌和骨髓中也检测到了 IFITM10 的表达。同时发现骨髓中表达量明显高于其他组织,而这可能与骨髓中的初生细胞数量多有关。IFITM5 和 10 在组织的表达图谱中有很多相似的地方,如骨髓中的表达量均为最高,平滑肌中的表达量均明显高于骨骼肌,肠道、生殖系统相关器官无表达,这种现象是否与二者的同源性[131]有关。IFITM5 和 IFITM10 在平滑肌中表达量均明显高表达与骨骼肌,这种差异性的表达有待揭示。综上所述,物种的不同是基因表达差异不可忽视的因素。干扰素诱导的跨膜蛋白定位与细胞膜上,在抵抗病毒入侵的机制一直是研究的热点。近几年,IFITMs 与肿瘤的关系也已经成为研究热点,如 IFITM1 可促进大肠癌的转移[98],而且进来发现可作为子宫内膜样腺癌中新型标记物[134]。因此如何揭示 IFITMs 在生理活动中的作用、表达的规律显得尤为重要。本文通过分析 IFITMs 在大鼠不同组织中的表达图谱,,旨在为进一步深入研究奠定基础。
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参考文献(略)

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