TAGLN2调控视网膜小胶质细胞免疫反应及细胞功能的作用探讨

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论文字数:36233 论文编号:sb2022053011061847997 日期:2022-06-09 来源:硕博论文网

本文是一篇临床医学论文,本实验设计了 3 条靶向 TAGLN2 基因的 siRNA 目的序列,并通过筛选,选出沉默效率最高的 siRNA,用于设计与病毒载体相连的 shRNA 并将其克隆至 GV248 质粒中。RT-PCR 及 Western Blot  实验结果鉴定显示小胶质细胞中 TAGLN2 沉默成功。
1 TAGLN2 沉默细胞株的构建
1.1  材料及仪器
1.1.1  主要实验仪器及设备
转胶蛋白 2(Transgelin 2,TAGLN2)是一种肌动蛋白结合蛋白,由 TAGLN2 基因编码,通过调节肌动蛋白维持细胞骨架重塑以发挥作用。TAGLN2 是本课题组前期采用蛋白质组学技术研究小鼠视网膜组织免疫反应机制时发现的差异蛋白。目前关于TAGLN2 的研究报道较少,TAGLN2 在视网膜细胞中的具体功能还有待深究。以往研究主要集中在 TAGLN2 在肿瘤相关疾病的发生发展中的作用。最近的研究表明 TAGLN2参与免疫反应,在免疫细胞中发挥关键作用。然而 TAGLN2 对小胶质细胞的免疫调控作用及功能影响还尚未阐明。本实验利用慢病毒介导 RNA 干扰(RNA  interference,RNAi)建立稳定沉默 TAGLN2 的 BV2 小胶质细胞株,为后续通过转录组测序发掘基因沉默后与免疫相关的基因、信号通路的变化以及沉默后对细胞功能的影响等实验提供基础,以进一步探讨 TAGLN2 对小胶质细胞免疫调控作用。

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1.2  主要实验方法
1.2.1 BV2 小胶质细胞及 293T 细胞的复苏、培养传代、冻存
(1)细胞复苏 将保存于液氮中的 BV2 细胞、293T 细胞置于 37°C 恒温水浴锅中快速摇晃使其解冻复苏,温度尽快达到零度以上;待其融化后快速将冻存细胞移至含 2ml 培养基的 15ml离心管中,混匀;设置 1000r/min,室温离心 5min,弃上清;用 1ml 培养基悬浮细胞沉淀,吹打均匀后移至培养瓶;置于显微镜下观察,若 90%的细胞形态为圆形且透光性佳,则复苏成功。
(2)细胞培养
接上步骤,计数细胞,接种 5×105个细胞于 25cm2细胞培养瓶中,接种前每瓶中先放入 3-4ml 的培养基。使用含 10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)及双抗的 DMEM培养基,放入细胞培养箱(37℃,5%CO2)中培养。
(3)细胞传代
接上步骤,当细胞生长融合率达 80%以上时,小心弃去细胞培养基,用 1×PBS 缓冲液洗涤 1-2 次,每瓶细胞加入 1ml 质量分数 0.25%  胰蛋白酶-EDTA 消化液消化贴壁细胞;显微镜下观察待细胞变圆开始脱落时,用含有 10% FBS 的培养基终止消化过程,使用移液管吹打贴壁细胞使其脱落,将细胞悬液移入 15ml 离心管;室温,1000r/min 标准离心 5min,弃上清;用 1ml 培养基悬浮细胞沉淀,吹打均匀后移入培养瓶进行 1:3 传代。
(4)细胞冻存
消化收集处于对数生长期且融合度近 80%-90%的细胞,室温下,1000r/min 标准离心 5min,弃上清;使用 1ml 细胞冻存液悬浮细胞并混匀,快速转移至细胞冻存管中,放入-80℃冰箱中的梯度冻存盒保存,过夜后转入液氮中冻存。
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2  转录组测序分析 TAGLN2 调控小胶质细胞免疫反应的作用机制
2.2  实验方法
2.2.1  转录组测序分析
细胞样本使用 Trizol Reagent 试剂提取总 RNA,通过 Fragment Analyzer 进行浓度和质量检测,通过 NanoDrop 和 Agilent  分析系统检测 RNA 浓度和质量,构建 mR NA 文库,质量合格的 RNA 由武汉华大医学检验所使用 BGISEQ-500 平台进行转录组测序,reads 均匀分布在被覆盖的大部分转录本的各区域。原始数据( raw  reads )通过Trimmomatic 软件过滤掉包含接头(接头污染)的 reads、未知碱基 N 含量大于 5%的 reads、低质量 reads,以得到高质量序列(clean reads)。用 HISAT 与 Bowtie2 分别将 clean reads比对到参考基因组序列及参考基因序列。本研究将|log2Fold  Change|≥1、P≤0.05 的基因作为筛选 DEGs 的标准,转录组测序数据通过 Dr.Tom 系统及其他生物信息学技术进行分析。 
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2.3  结果
2.3.1  转录组测序分析 TAGLN2 调控小胶质细胞免疫反应
(1)差异表达基因分析
收集 Con 组与 shTAGLN2 组两组细胞进行转录组测序分析,共检测出 16149 个基因。用 Venn 图表示 Con 组与 shTAGLN2 组测序后检测出的基因数(图 4A),Venn 图中重叠区域的数字代表两组之间共有的基因 14330 个,而仅在 Con 组、shTAGLN2 组表达分别为 608、1211 个基因。以|log2(Fold Change)|≥1,P≤0.05 为筛选 DEGs 的标准,Con组与 shTAGLN2 组共筛选出  635 个显著 DEGs,占总检测基因数的 4%。其中有 456 个DEGs 显著上调(log2(Fold  Change)≥1,P≤0.05),有 179 个 DEGs 显著下调(log2(Fold Change)≤-1,P≤0.05)(见图 4B);绘制火山图示,shTAGLN2 组与 Con 组的 BV2 小胶质细胞中差异表达基因的分布情况。其中,红色点表示表达显著上调的 DEGs,绿色点表示表达显著下调的 DEGs,灰色表示非显著性 DEGs(图 4C)。聚类热图示 DEGs表达变化情况,样品来自于同一个组别,其特征相似的,聚类时会聚在一起,从聚类热图上分析,样本重复性好,两组间基因表达存在明显差异(图 4D)。

临床医学论文参考
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3 TAGLN2 对小胶质细胞功能作用的影响 ......................... 31

3.1  主要实验材料 .................................... 31
3.1.1  主要实验仪器及设备 ........................ 31
3.1.2  主要试剂材料 ....................................... 31
4  总结与结论 ......................................... 39
3 TAGLN2 对小胶质细胞功能作用的影响

3.1  主要实验材料
3.1.1  主要实验仪器及设备
第一部分结果表明 TAGLN2 在小胶质细胞中的表达情况以及沉默细胞株的成功构建。已有研究证明 TAGLN2 参与调控免疫反应,并且通过调节肌动蛋白微丝结构来维持细胞骨架,进而调控细胞功能,包括细胞增殖、分化、凋亡、迁移和细胞信号传导等[63-65]。因此,免疫及炎症反应中细胞功能的变化对了解 TAGLN2 的作用机制也是必要的。目前针对 TAGLN2 对小胶质细胞功能影响的有关报道十分缺乏。本实验不仅通过转录组测序从基因水平上分析 TAGLN2 沉默后小胶质细胞表达谱的变化。我们还从细胞水平上观察 TAGLN2 对细胞功能的影响。本章节利用课题组前期成功构建的稳定沉默的细胞株进行实验,明确 TAGLN2 基因沉默对小胶质细胞的增殖、凋亡、迁移等细胞功能的影响。

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4  总结与结论
过度活化的视网膜小胶质细胞分泌炎性因子及趋化因子引起炎症反应是眼底多种疾病发生发展的主要机制。目前,探索小胶质细胞活化和炎症反应发生后所参与的免疫调控机制值得我们研究。本实验以稳定沉默 TAGLN2 基因的小胶质细胞为研究对象,通过转录组测序和生物信息学分析探究 TAGLN2 调控小胶质细胞免疫反应的分子机制以及 TAGLN2 沉默后对细胞功能的影响,为治疗炎症性视网膜疾病提供新的实验依据及治疗靶点。以下对本实验进行总结:
本实验设计了 3 条靶向 TAGLN2 基因的 siRNA 目的序列,并通过筛选,选出沉默效率最高的 siRNA,用于设计与病毒载体相连的 shRNA 并将其克隆至 GV248 质粒中。RT-PCR 及 Western Blot  实验结果鉴定显示小胶质细胞中 TAGLN2 沉默成功。
将 LV-TAGLN2-shRNA 慢病毒感染细胞后,通过嘌呤霉素筛选,单克隆培养,获得TAGLN2 蛋白及 mRNA 表达量极低的细胞株。将基因沉默组与对照组通过转录组测序得到基因转录谱的表达变化。
GO 功能富集分析发现 TAGLN2 可能通过调控不同的 DEGs,发挥多种分子功能,从而参与不同的生物学过程。调控小胶质细胞的活化,从而参与视网膜慢性炎症性疾病的发展。上调的  DEGs 与免疫系统进程和鞘氨醇代谢进程等生物学过程有关,而下调的 DEGs  与固有免疫应答等生物学过程有关。已有研究表明,正常小胶质细胞会降低 MHC II 类抗原表达,此时维持细胞处于静止的监视状态[45]。而在 GO 功能富集中我们得出,TAGLN2 沉默后,MHCII 呈递抗原识别抗体功能被激活。
KEGG 通路富集分析显示,TAGLN2 激活多种炎症信号生物学通路,进而参与调控小胶质细胞免疫功能。我们的研究发现小胶质细胞沉默 TAGLN2 基因后 Jak-STAT 信号通路被激活,多种趋化因子及其受体表达增加,Th1、Th2 和 Th17 细胞分化增加,T 细胞受体信号通路被激活。
参考文献(略)


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