和厚朴酚抑制血管紧张素Ⅱ诱导的血管重塑及血管平滑肌细胞表型转换的效应和机制

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论文字数:26525 论文编号:sb2022022516423244269 日期:2022-03-05 来源:硕博论文网
本文是一篇临床医学论文,笔者经过研究,得出以下结论:1. HKL 可显著抑制 AngⅡ诱导的大鼠胸主动脉重塑、VSMCs 表型转换及增殖;2. Akt 抑制剂可抑制 AngⅡ诱导大鼠胸主动脉 VSMCs 表型转换及增殖;

材料

1 实验动物
SPF 级雄性 Sprague Dawley(SD)大鼠 32 只,8 周龄,体重 180±20g,购自上海斯克莱斯实验有限责任公司(Slac Laboratory Animals Co. Ltd),许可证号:SCXK(沪 2012-0002)。饲养于福建医科大学 SPF 级动物房,饲养条件:标准鼠笼,每笼 4-5 只,恒温 20±2℃,恒湿 55±5%,人工光照明暗 12h/d,光照时间(07:00-19:00),自由摄食饮水。
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2 主要实验试剂
Tris (Sigma 公司);SDS(Sigma 公司);Tween20(美伦生物科技有限公司);Tween80(VICMED 公司);RIPA 裂解液(上海碧云天生物技术有限公司);PMSF(上海碧云天生物技术有限公司);DTT(上海碧云天生物技术有限公司);Akt 抑制剂 MK2206(上海碧云天生物技术有限公司);1640 培养基(Gibco 公司);青霉素和链霉素溶液(Gibco 公司);0.25%胰蛋白酶(Gibco 公司);胎牛血清(Gibco 公司);Akt 抗体(Abways 公司);p-Akt 抗体(Cell Signaling Technology);PCNA 抗体(Abcom 公司);OPN 抗体(Santa Cruz 公司);β-actin 抗体(Santa Cruz公司);山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗(北京中杉金桥);免疫组化二抗试剂盒、DAB 显色试剂盒、苏木素、中性树胶(北京中杉金桥生物技术有限公司);血管紧张素Ⅱ(Sigma 公司);蛋白 marker(26616)(Thermo Fisher Scientific);可曝光 marker(新海基因生物科技有限公司);PVDF 膜(Millipore 公司); 牛血清白蛋白(Solarbio 公司);细胞培养板(Thermo Fisher Scientific 公司);CCK8检测试剂盒(美伦生物科技有限公司);和厚朴酚(南京春秋生物科技有限公司);胶囊给药泵(上海玉研科学仪器有限公司)
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实验方法

1 动物实验
1.1 实验动物分组及血管重塑模型构建
32 只 SD 雄性大鼠随机分为 4 组:1)对照组(Control 组,n=8);2)血管紧张素Ⅱ组(AngⅡ,520ng/kg/min ,n=8);3)AngⅡ+HKL2.5mg/kg/d 组(AngⅡ+HKL2.5,n=8);4)AngⅡ+HKL5mg/kg/d 组(AngⅡ+HKL5,n=8)。
通过埋置皮下的胶囊泵以 520ng/kg/min 的速率持续泵注AngⅡ四周构建大鼠血管重塑模型,其中对照组用胶囊泵泵注等量的生理盐水,所有动物实验操作经由福建医科大学实验动物伦理委员会许可。
1.2 和厚朴酚的处理及给药方式
按花生油:吐温 80:双蒸水=1:1:8 的比例将和厚朴酚溶解于三者的混悬液中,腹腔注射给药,每天两次,连续四周。
1.3 大鼠胸主动脉取材
(1)3%戊巴比妥钠,按 50mg/kg 的剂量腹腔注射麻醉大鼠 5-10 分钟;
(2)迅速剖开胸腔,暴露心脏,分离胸主动脉,切取主动脉弓下 1cm 胸主动脉血管,剥除外膜结缔组织。
1.4 大鼠胸主动脉死苏木素-伊红染色(HE 染色)
(1)取下大鼠胸主动脉以 PBS 冲洗 2-3 次,投入 10%福尔马林固定 48h;
(2)从福尔马林液中取出大鼠胸主动脉组织,自来水冲洗 30min,70%-100%酒精梯度脱水各 5min,二甲苯中透明 30min;
(3)将已透明胸主动脉组织置于已溶化的石蜡中,放入溶蜡箱保温,待石蜡完全浸入组织块后进行包埋;
(4)将包埋好的蜡块固定于切片机上,切成 4-6um 薄片,切下的薄片放到加热 40-50℃热水中烫平,再贴到载玻片上,放 60℃烤箱 30min;
(5)从烤箱中取出载玻片放入二甲苯 15min,二甲苯 25min,100%-75%酒精梯度水化,每步 3-5min,放入自来水水洗 10min;
(6)取出载玻片,滴加即用型的苏木素 1-2min,酸水及氨水中分色,各数秒;
(7)流水冲洗 1-2min 放入蒸馏水片刻,75%和 95%酒精中脱水各 5min;
(8)入酒精伊红染色液染色 2-3min,染色后的切片经 95%酒精 30s,晾干;
(9)切片滴加中性树胶,盖上盖玻片,晾干,贴上标签。
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2 细胞实验
2.1 胸主动脉平滑肌细胞的培养及干预
按照文献组织贴壁[44]的方法,取 4 周龄 Sprague Dawley 大鼠胸主动脉组织贴壁法培养血管平滑肌细胞。步骤如下:
(1)3%戊巴比妥钠,按 50mg/kg 的剂量腹腔注射;麻倒后颈椎脱臼处死大鼠,75%酒精浸泡 3~5min,放到无菌操作台上继续操作,用剪刀沿着大鼠腹正中线向上剪开胸腔,将大鼠左肺向右侧翻转,可见贴于脊柱右侧胸主动脉走行。上端沿主动脉弓,下端至膈的主动脉裂孔处,完整剪取胸主动脉,置于预先装有 PBS 的无菌培养皿中;
(2)用镊子轻轻剥离血管外结缔姐织,移至另一装有 PBS 的无菌培养皿;
(3)用眼科剪沿纵轴剪开血管条,无菌镊轻轻刮除内膜,移至另一无菌培养皿;
(4)用镊子钝性加压刮中膜 2 次,待出现裂口后夹住中膜将其取下;
(5)将取下的中膜加入含 10%胎牛血清的 1640 培养液,用眼科剪剪碎血管条,使组织块大小约 1mm×1mm×lmm;
(6)用无菌滴管将组织块吸入细胞培养瓶,均匀铺于瓶壁,间距约 0.2~0.5cm;
(7)将培养瓶倒置放置于 37℃/5%CO2 细胞培养箱;在含 10%胎牛血清、1%双抗(青霉素、链霉素)、5%CO2 的 1640 培养基中培养。(8)4h 后轻轻放平,37℃/5%CO2 细胞培养箱中绝对静置 3 天;
(9)此后每 2-3 天换液 1 次;4 天左右可以有细胞自组织周围爬出。
(10)通过倒置相差显微镜对观察细胞形态带细胞生长达到 80%-90%汇合后进行传代,每隔 2-3 天更换一次培养基。
干预:为了诱导 VSMCs 表型转换,取 3-6 代的细胞进行干预实验,根据先前实验,选择 Ang Ⅱ、HKL 干预浓度为 10-6M(mol/L)及 10-7M,细胞分组:Ⅰ:空白对照组(Ctr)组、Ang Ⅱ(10-6M)组、Ang Ⅱ(10-6M)+HKL(10-7M)组;Ⅱ:空白对照组(Ctr)组、Ang Ⅱ(10-6M)组、Ang Ⅱ(10-6M)+MK2206(10-6M)组。
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实验结果.......................... 18
1 动物实验................................18
2 细胞实验.........................22
讨论................................... 29
结论........................... 31


讨论


本研究观察到在胶囊渗透泵持续将 AngⅡ泵入大鼠体内四周的情况下,AngⅡ诱导大鼠胸主动脉中膜面积及血管壁厚度增加,上调 OPN、PCNA 蛋白表达水平,提高 VSMCs 增殖活力,发生血管重塑及 VSMCs 表型转换。血管紧张素Ⅱ(Ang Ⅱ)是 RAS 系统的主要生物活性肽[31],几乎影响所有血管细胞(内皮细胞,平滑肌细胞,成纤维细胞,单核细胞/巨噬细胞)[45],主要通过广泛分布于全身器官的血管紧张素 1 型受体(AT1R)介导其病理生理作用,两者结合后激活一系列信号级联反应,诱导 VSMCs 表型转换、增殖,影响 VSMCs 迁移和基质沉积,并导致血管内侧增厚和血管纤维化[46],在血管重塑中发挥作用[47],导致动脉弹性下降,促进血管收缩,提高血压水平[48]。AngⅡ在控制心血管稳态方面起着关键作用,与多种常见心血管疾病的密切相关,例如高血压,动脉粥样硬化,血管成形术后的再狭窄、主动脉夹层、动脉瘤和心力衰竭等[29, 49, 50]。而诱导的动脉僵硬度的增加与上述疾病的发病率和死亡率的增加有关。因此,抑制 AngⅡ和 AT1R 诱导的血管重塑及 VSMCs 表型转换,是许多心血管疾病药物的治疗靶点。A Kubo[51]和 Jian Teng等人[52]发现 ARB 可以抑制自发性高血压大鼠 VSMCs 中 AngⅡ诱导的 DNA 合成和VSMCs 增殖,并抑制细胞生长因子 mRNA 和蛋白表达,也可减少 AngⅡ诱导的增殖相关蛋白 PCNA 蛋白及 mRNA 表达增加[44],AT1R 阻滞剂(Angiotensin receptorblocker,ARB)、血管紧张素酶抑制剂(Angiotension converting enzyme inhibitors,ACEI)等药物目前广泛用于治疗高血压、动脉粥样硬化等心血管疾病[53],舒张血管,减轻血管壁增厚,改善血管顺应性,以此减轻动脉粥样硬化,降低血压,可一定程度减少心血管疾病患者的发病率及死亡率[54]。但目前心血管疾病仍是全球范围内的主要死亡原因,因此,对 AngⅡ诱导的血管重塑及 VSMCs 表型转换的机制进一步研究,发现减少与血管重塑相关的不良心血管事件的新药物与治疗靶点是必要的。Jingjing Lu 等人[55]发现 AngⅡ通过调控 Akt 磷酸化诱导脑血管平滑肌细胞增殖。

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结论


1. HKL 可显著抑制 AngⅡ诱导的大鼠胸主动脉重塑、VSMCs 表型转换及增殖;
2. Akt 抑制剂可抑制 AngⅡ诱导大鼠胸主动脉 VSMCs 表型转换及增殖;
3. HKL 可能通过 p-Akt 途径调控 VSMCs 表型转换及增殖,改善 AngⅡ诱导的血管重塑。
参考文献(略)


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