肝硬化患者门脉高压与肠壁通透性及炎症的相关性思考

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论文字数:33022 论文编号:sb2022021720334543665 日期:2022-02-23 来源:硕博论文网
本文是一篇临床医学论文,笔者经过研究,得出以下结论:门静脉高压进展可能会导致肠道免疫功能改变,增加肠道细菌(E.coli)移位至肠黏膜固有层的风险。

第一部分 肝硬化患者肠壁通透性与炎症相关性

1.1 研究对象和分组
研究对象是2018年 01月至2020年03月于我院肝内科住院确诊肝硬化患者。入选标准:①年龄大于 18 周岁;②符合肝硬化诊断;③非感染状态或者存在 SBP或脓毒血症。排除标准:①嗜肝病毒以外其他病毒或真菌感染;②合并血液疾病;③合并恶性肿瘤、急性肝衰竭;④甲状腺功能异常疾病;⑤合并急性心肌梗死;⑥妊娠或哺乳期女性;⑦有使用免疫抑制治疗或合并自身免疫性疾病或进行血液透析治疗患者;⑧合并炎症性肠病;⑨有创操作或有明确除腹腔以外其他部位感染引起脓毒血症。最终纳入 81 例患者。肝硬化诊断参考中华医学会肝病学分会2019 年发布的《肝硬化诊治指南》,失代偿期肝硬化的诊断依据是在肝硬化基础上,出现门静脉高压并发症和/或肝功能减退(Child-Pugh 评分:B 或 C),门静脉高压相关并发症主要有:如腹水、食管胃底静脉曲张破裂出血、脓毒症、肝性脑病、肝肾综合征等[13]。门脉高压症诊断依据是根据内镜下存在胃底食管静脉曲张、影像学出现侧支循环或出现腹水、肝性脑病等并发症进行临床综合判定。SBP诊断标准参考中华医学会肝病学分会 2018 年发布的《肝硬化腹水及相关并发症的诊疗指南》[14]。脓毒血症诊断标准参考《中国严重脓毒症/脓毒性休克治疗指南(2014)》[15]。根据有无合并脓毒血症或 SBP 将研究对象分为感染组和非感染组,肝硬化非感染组患者共有 51 例,其中非门脉高压症患者 24 例,合并门脉高压症患者 27 例。肝硬化感染组患者共有 30 例,其中单纯 SBP 患者 14 例,脓毒血症合并 SBP4 例,脓毒血症患者 12 例。
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1.2 数据收集
患者的临床资料包括性别、年龄、BMI、病因、Child-Pugh 评分、血常规、凝血全套、肝肾功能、肝脏影像学、胃肠镜。
使用含有惰性分离胶、促凝剂的黄头真空采血管采集每位患者外周静脉血3-6ml,血液标本静置至少 20 分钟后进行离心,离心速度 3000rpm,离心时间 10分钟,离心结束后取出标本,用一次性无菌吸管吸取上清液分装于冻存管中,每管 0.5ml,将冻存管做好标记后置入-80℃冰箱保存,待后续检测时统一取出使用。
(1)1×洗液:检测 claudin3 时用去离子水稀释 25×浓缩洗液 30ml 至 750ml。检测 sCD14 时用去离子水稀释 30×浓缩洗液 20ml 至 600ml。轻轻混匀,避免泡沫。
(2)生物素标记抗体/检测试剂 A 稀释:计算所需溶液的体积,用试剂盒自带的稀释液按 1:100 稀释浓缩的生物素标记抗体/检测试剂 A。(使用前 1 小时内制备)
(3)SABC 溶液/检测试剂 B 稀释:计算所需溶液的体积,用试剂盒自带的稀释液按 1:100 稀释浓缩的 SABC/检测试剂 B。(使用前 30 分钟内制备)
(4)标准品稀释:在一个 EP 管中用 1ml 稀释液重溶标准品,在室温下保持 10 分钟,并将其轻轻混匀,重溶后标准品为浓缩标准品。再取 7 个 EP 管,分别为 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、空白管。检测 claudin3 时每管中加入0.3ml 稀释液;取 0.3ml 浓缩标准品加入 1/2 管中,充分混合;取 0.3ml1/2 管中液体转移至 1/4 管中。检测 sCD14 时每管中加入 0.5ml 稀释液;取 0.5ml 浓缩标准品加入 1/2 管中,充分混合;取 0.5ml1/2 管中液体转移至 1/4 管中。以此类推。
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结果
2.1 临床基线资料
本研究共纳入 81 例肝硬化患者,并根据有无合并门脉高压症、感染分为 3组。如表 1 所示,A组为无门脉高压症非感染状态的肝硬化患者;B 组为门脉高压症非感染状态的肝硬化患者;C组为门脉高压症合并感染的肝硬化患者。A 组患者 24 例,平均年龄 50.44±9.70 岁。B 组患者 27 例,平均年龄 59.22±10.35 岁。C 组患者 30 例,平均年龄 57.18±7.73 岁。将 A、B、C 三组患者的一般特征及临床数据进行对比后得出三组患者的年龄、Child-Pugh 评分、血清中 WBC、NEUT%、LYMP、LYMP%、HB、PLT、ALB、TC、CRP、PCT 水平差异均具有统计学意义(p<0.05),而三组患者的 BMI、病因、性别、NEUT、TG、ALT、AST、GGT、GFR、Cr、GFR 差异均无统计学意义(p>0.05)(表 1)。经过 t 检验进行 2 组比较,A 组患者年龄低于 B 组患者,差异具有统计学意义(t=2.544,p=0.016);经过 Mann-Whitney u 检验进行 2 组比较,A 组患者的 WBC(u=39.5,p<0.001)、NEUT(u=70.0,p=0.010)、LYMP(u=32.0,p<0.001)、LYMP%(u=66.0,p<0.006)、HB(u=39.5,p<0.001)、PLT(u=9.0,p<0.001 )、ALB(u=12.0,p<0.001 )等指标均高于 B 组患者,Child-Pugh 评分(u= 276.0,p<0.001)、AST(u= 213.0 ,p=0.017)、GGT(u= 203.0 ,p=0.042)低于 B 组患者,差异均有统计学意义(p<0.05);而 A 组和 B 组性别、病因、BMI、NEUT%、ALT、TC、TG、肾功能、CRP、PCT 水平差异均无统计学意义(p>0.05)(表 1)。C组患者的 PCT、CRP 水平高于 B 组患者(Fisher 确切概率法),差异具有统计学意义(p<0.01),C 组患者血清 NEUT%高于 B 组(u=282.0,p=0.022),血清 TC(u=113.5,p=0.020)、LYMP%(u=116.5,p=0.026)低于 B 组患者。而 B 组和C 组患者在年龄、性别、病因、Child-Pugh 评分、血清中 WBC、NEUT、LYMP、HB、PLT、ALB、BMI、NEUT、ALT、AST、GGT、TG、肾功能水平差异均无统计学意义(p>0.05)(表 1)。
临床医学论文参考
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2.2 非感染状态肝硬化合并门脉高压症患者肠壁通透性与炎症因子相关性
2.2.1 非感染状态肝硬化患者有或无门脉高压症的血清 claudin3、I-FABP 表达差异
如表 2 所示,A组为无门脉高压症非感染状态的肝硬化患者:B 组为门脉高压症非感染状态的肝硬化患者。B 组患者血清 I-FABP 水平高于 A 组,差异有统计学意义(p<0.01);B 组患者血清 claudin3 水平相比 A 组升高,但差异无统计学意义(p>0.05)(表 2)。
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第二部分 肝硬化门脉高压对肠壁巨噬细胞免疫功能的影响............27
材料和方法......................27
结果............................... 30
讨论................................ 38
结论................................... 40

讨论
在正常情况下,肠道屏障可以阻止大多数细菌的移位,只有极少量的细菌或者细菌产物会经过肠道屏障到达肝脏,而后它们会被肝脏的免疫细胞如库普弗细胞(Kupffer Cell)等清除[3],肠道屏障功能障碍导致细菌移位增加。肠屏障功能包括机械、免疫、生物、化学屏障,机械屏障由肠上皮细胞和细胞间的紧密连接组成,免疫屏障由肠道相关淋巴组织、效应和调节性 T 细胞、浆细胞、巨噬细胞和树突状细胞等组成[34]。肠巨噬细胞主要位于黏膜固有层。失代偿期肝硬化患者的肠壁通透性增加,大量肠道细菌进入肠黏膜固有层,与肠黏膜免疫系统相互作用,最终导致肠黏膜免疫系统受损,肠道固有层免疫细胞受损[35]。第一部分研究结果表明肝硬化门脉高压症患者血清学肠道通透性指标增加,目前较少有关于肝硬化门脉高压患者肠道病理的免疫屏障功能研究报道,因此本研究收集具有门脉高压症患者与非门脉高压症患者肠道黏膜活检病理验证肠壁巨噬细胞免疫功能与细菌移位关系。
肝硬化患者发生自发性细菌性腹膜炎和自发性血流感染的病原学主要为大肠杆菌[36]。肠道细菌及其产物(LPS)从肠道移位是晚期肝硬化患者发生全身炎症反应的主要因素,巨噬细胞有 M1 和 M2 两种表型,M1 型巨噬细胞主要分泌促炎因子,参与正向免疫应答,对感染病原学发挥免疫监视作用。LPS 可诱导M1 型巨噬细胞激活,M1 型主要通过表达诱导型 iNOS 进而消灭病原菌[37, 38]。CD14+TREM1+巨噬细胞表达 iNOS 并分泌 NO 和 IL-6,是细胞因子/趋化因子的主要细胞来源[11]。CD68 是巨噬细胞标志分子,因此本研究采用 CD68 作为巨噬细胞标志物,iNOS、CD14 可作为 M1 型巨噬细胞功能标志物。本研究结果表明门脉高压症患者肠粘膜固有层细胞 CD68 阳性率、iNOS 阳性率、CD14 阳性率均高于非门脉高压症患者,可以推断门脉高压症患者肠黏膜巨噬细胞数量增多,M1 型巨噬细胞增多可能,但需进一步完善免疫组化双染验证是否为巨噬细胞M1 型表型。门脉高压症患者肠腺中大肠杆菌阳性率高于非门静脉高压症患者,肠腺中大肠杆菌阳性率与固有层巨噬细胞分子标志物 CD68 阳性率、CD14 阳性率、iNOS 阳性率均呈正相关。
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结论
1、肝硬化合并门脉高压症患者肠黏膜固有层 CD68、CD14、iNOS 免疫组化表达增多,考虑肝硬化门脉高压症患者肠黏膜巨噬细胞数量增多,M1 型巨噬细胞增多可能。
2、门静脉高压进展可能会导致肠道免疫功能改变,增加肠道细菌(E.coli)移位至肠黏膜固有层的风险。
参考文献(略)

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