β-榄香烯对人食管内镜下黏膜下剥离术后成纤维细胞的抑制作用

论文价格:150元/篇 论文用途:硕士毕业论文 Master Thesis 编辑:硕博论文网 点击次数:
论文字数:19555 论文编号:sb2022021222070143518 日期:2022-03-13 来源:硕博论文网

本文是一篇临床医学论文,本研究是在细胞水平上进行的,后续探究β-榄香烯对食管ESD术后食管疤痕作用机制问题的动物实验和临床试验,课题的其他人正在进行中,希望为将来应用于临床转化做好铺垫。

1 材料

1.1 病例选择
选取2019年1月-3月在我院消化内镜中心因食管早癌或高级别上皮内瘤变行ESD术,且黏膜切除范围超过2/3周的病人5例,本研究已通过我院伦理审查,伦理编号:[2019]福医附二伦理审字第(221)号。
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1.2 主要的实验仪器

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2 方法

2.1 人食管ESD术后成纤维细胞体外培养、纯化、传代
①在电子胃镜下用无菌活检钳夹取少许肉芽组织,放置于装有无菌生理盐水(0-4℃)的试管中,迅速转移至超净工作台;②将组织置于培养皿中,用生理盐水和1%莫西沙星溶液交替漂洗2遍以去除血污;③用胰酶-EDTA消化组织十分钟;④于六孔板小皿中预先滴一滴胎牛血清;⑤用无菌镊子将组织块夹出贴于六孔板小皿中;⑥将组织盖上无菌盖玻片;⑦轻轻加入20 %胎牛血清的高糖DMEM培养基,使其刚好没过组织块和盖玻片;⑧放入37℃ CO2培养箱中,3-5天更换一次培养基;⑨待原代细胞从组织块中爬出并贴壁生长在皿底和盖玻片后剔除盖玻片;⑩将玻片放置于另一培养皿中,分别继续培养5-7天后用胰酶-EDTA进行“原孔消化”:即使用胰酶-EDTA消化细胞后加入20 %胎牛血清的高糖DMEM培养基洗脱盖玻片和皿底的贴壁细胞并留至原培养皿中,放入37℃ CO2培养箱中,3-5天更换一次培养基;⑪待细胞大于50%融合后,将其传代至25cm2培养瓶中继续培养。⑫传代至3代后将胎牛血清浓度降至10-15%,成纤维细胞作为优势细胞继续生长,而其他上皮细胞等将逐渐减少甚至消亡,成纤维细胞得以纯化。⑬选取5-8代,不超过10代的细胞用于实验。
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2.2 成纤维细胞鉴定
①取爬片的 P5-6 代细胞②PBS 清洗 3 次③10%福尔马林浸泡 15min④自然风干 5min⑤PBS 清洗 3 次⑥用 0.5%Triton X-100(PBS 配)孵育 20 min;⑦PBS 清洗 3 次⑧内源性过氧化酶去除剂孵育 10min⑨PBS 清洗 3min×3 次⑩加入一抗室温孵育 2h(鼠抗人波形蛋白、兔抗人角蛋白、非免疫血清代替一抗作阴性对照)⑪PBS 清洗 3min×3 次⑫加入二抗增强反应液室温孵育 20min⑬加入二抗室温孵育 30min⑭PBS 清洗 3min×3 次⑮轻轻甩干后加 DAB 显色液覆盖孵育 3min⑯苏木素复染 15s⑰自来水冲洗 20min⑱中性树胶封片⑲显微镜下观察照相

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3 结果.......................................... 16
3.1 成功培养成纤维细胞.....................................16
3.2 成纤维细胞波形蛋白和角蛋白的表达情况.............................. 16
3.3 各分组细胞抑制率的比较..........................17
3.4 各分组细胞凋亡率的比较......................................17
3.5 各分组的 p-ERK1/2、p-P38 蛋白的表达量的比较..................18
讨论............................ 20
结论.................................. 22


讨论
ESD 术是在内镜下采用黏膜切开刀切开病变组织周围的粘膜,从粘膜的下层剥离切除病变的一种微创治疗手段,在食管 ESD 术中人为的形成一个人工伤口。在伤口的愈合过程中会发生组织的纤维化、伤口挛缩和瘢痕形成。任何能引起组织细胞损伤的原因,都可导致组织细胞发生变性、坏死和产生炎症反应,如果损伤很小,损伤细胞周围正常的实质细胞会开始增生修复,其可以完全恢复正常的结构和功能。但范围较大或反复的损伤超出了它的再生修复能力时,间质纤维结缔组织将会大量增生对缺损组织进行修复,此为纤维化的病理改变。因此纤维化的本质其实是组织受到损伤后的机体自我修复反应,来保证组织的相对完整性。缺损虽然被增生的纤维结缔组织填充修复,但却失去了原来缺损细胞的结构和功能。Honda 等人[30]的一项动物实验观察了 EMR 术后创面的愈合过程,发现固有肌层萎缩导致了纤维化,最终引起了食管狭窄,Nonaka 等人[31]的实验则发现增生的平行分布的梭形成纤维细胞在食管环周 ESD 术后狭窄的发生过程中起到重要作用。故纤维化及成纤维细胞在食管狭窄的发生发展中起到了重要作用。而食管 ESD术后狭窄是困扰患者预后的一个难题,患者常常会因为吞咽困难而使生活质量下降,所以术后狭窄的防治变为极其重要,目前的防治方法主要包括预防性球囊扩张、预防性食管支架置入、糖皮质激素及丝裂霉素局部注射、内镜下细胞移植等,这些方法虽可以缓解部分术后食管狭窄情况,但其有效性有一定的局限性,所以需探究其他药物在抑制成纤维细胞方面的作用。
在食管愈合的过程中,纤维化和食管疤痕的形成是引起食管狭窄的主要原因,其中成纤维细胞是最主要的修复细胞,因此体外成功培养食管原代成纤维细胞、建立细胞模型,对于研究如何有效地抑制食管成纤维细胞生长并探索可能的机制,是解决问题的关键。我们的实验通过借鉴我院其他团队洪苓苓等人培养人类气道原代成纤维细胞的经验,采用“胰酶消化法”、“组织贴壁法”和“血清贴壁法”、“组织压片法”等改进方法成功在食管 ESD 术后 1 个月的患者获取肉芽组织并培养食管原代成纤维细胞,并在其后的免疫细胞化学实验中得到鉴定,成功建立细胞模型,为后续实验提供了保障,说明体外培养食管原代成纤维细胞是可行的,但其培养的成功率仍然有限,有待未来有更好的方法来进一步的提高。
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结论
1、食管ESD术后愈合的过程中,纤维化是引起食管狭窄的主要原因
2、β-榄香烯对食管ESD术后的成纤维细胞具有抑制生长的作用,其机制可能通过下调ERK1/2、上调P38蛋白的磷酸化表达来诱导凋亡,从而抑制细胞的增殖
参考文献(略)


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